利用系統生物學分析技術建構大豆耐淹水生物反應途徑網絡圖譜及核心基因選拔

大豆[Glycine max（L.）Merr.]為全球重要糧食作物，但對於淹水逆境極為敏感，易導致產量大幅下降。淹水耐受性為多基因調控之複雜性狀，涵蓋訊號傳導、荷爾蒙代謝、抗氧化反應等層面。傳統育種難以有效篩選耐淹水基因組成，因此本研究透過多體學與非體學資料整合與系統性的路徑網絡分析，針對本實驗室前期選拔的耐淹水基因（flood-tolerance genes，FTgenes）進行系統層次探勘，以期找出具應用潛力之調控節點。本研究分析架構包含五大模組：（1）整合FTgene資料庫與基因註解；（2）整合不同假說的pathway enrichment分析，擷取顯著富集的生物途徑；（3）路徑交互與crosstalk分析，選拔重要核心基因；（4）FTgenes基因共表現網絡建構與關鍵基因篩選；（5）外部資料驗證與qRT-PCR驗證。我們採用GO註解作為pathway分類依據，並以SoyNet進行網絡圖譜分析。本研究收集並分析106，263筆基因型資料（可map到36，705個基因）與28個核心基因，進行基因優化演算，最終選拔出144個大豆耐淹水基因FTgenes，其加總分數（combined score）在染色體第5、13與15位置表現高峰，顯示特定染色體區域為可能調控熱點（圖一）。此外，FTgenes之分數分布也反映出整體顯著性在多時間點具一致性與穩定性（圖二），顯示在後續基因途徑富集與網絡分析，對FTgenes潛在new insights的可能性。
在富集分析方面，Hypergeometric test鑑定出24條顯著路徑，主要涉及與植物激素調控、逆境反應、初級代謝、防禦反應與細胞壓力處理相關（圖三）。特別是ABA與乙烯相關途徑在淹水初期即啟動防禦反應機制，且在6 hr與12 hr仍維持高度顯著。此外，有24條pathway在時間動態上對淹水反應呈現路徑的持續性參與。SUMSTAT與SUMSQ方法亦驗證這些路徑的FTgenes群體層級顯著性，與低氧反應、防禦反應、活性氧調控、激素訊號及能量代謝（glycolysis、gluconeogenesis）路徑高度相關相關（圖四）。我們在兩種self-contained方法鑑別出4個共通關鍵FTgenes（包括Glyma.13g361900涉及ABA transpor t、ethylene response、ATP catabolic process；Glyma.15g011900及Glyma.15g012000均屬於ABA與乙烯相關的信號傳導與能量代謝關鍵點；Glyma.14g127800與植物激素運輸和能量產生相關）以及4個高路徑覆蓋率的基因（Glyma.02g195300、Glyma.08g218600、Glyma.05g021100及Glyma.14g102900具高度路徑整合潛力，為多功能調控中樞）。此外，有5條pathway在時間動態上對淹水反應呈現路徑的持續性參與。
本研究整合不同方法，挑選出36條顯著富集路徑，顯示FTgenes主要集中於植物免疫與代謝重塑等反應模組，有助於從全基因層級中，篩選出在耐淹水環境下明顯活躍的關鍵途徑。我們利用SoyNet與Cytoscape分析在不同策略下建立密集（degree介於20-30）的關鍵子網絡，選拔與多個功能模組有高度關聯的關鍵基因。策略一：我們利用144個FTgenes建立基因路徑交談網絡，從23個高度中心性基因，選拔8個在多個功能模組有高度關聯的FTgenes，為可能的調控樞紐（圖五）。策略二：我們從24條顯著的路徑挑選出FTgenes，建立基因路徑交談網絡，從77個FTgenes與29個中介基因，選拔20個具高度連結性與調控潛力的FTgenes（圖六）。策略三：我們從5個跨時間動態的路徑挑選出34個FTgenes，建立基因路徑交談網絡，從29個高度中心性基因，選拔6個在多個功能模組有高度關聯的關鍵基因，為可能的調控樞紐（圖七）。策略四：我們從5個跨方法的路徑挑選出25個FTgenes，建立基因路徑交談網絡，從25個FTgenes與26個中介基因，選拔4個具高度連結性與調控潛力的關鍵基因（圖八）。我們從SoyNet與共表現網絡中，依top pathways交集與score整合鑑定出9個關鍵節點基因高度參與多條路徑的交錯點，顯示其在耐淹水反應中具有多面向的調控角色。
為驗證經系統分析選出的耐淹水關鍵基因（key FTgenes），本研究針對5個顯著富集且於兩種方法均重疊的pathway中，進一步篩選25個FTgenes，建構共表現網絡後，鑑定出4個高度連結（degree≥26）的核心基因（Glyma.13g361900、Glyma.15g012000、Glyma.15g011900與Glyma.14g127800），與淹水逆境調控相關之訊號傳遞與荷爾蒙運輸功能，顯示其在耐淹水調控中的核心角色。統計分析顯示，這些基因在外部RNA表現資料中具顯著表現差異（p < 0.001）（圖九）。整合表現資料與網絡分析，選出9個關鍵FTgenes，涵蓋訊號傳遞、能量代謝、酵素活性與未知功能等模組（圖十）。進一步以qRT-PCR驗證9個代表性FTgenes在大豆根部受淹水處理後的表現變化，結果顯示其中8個在3至24小時內顯著上調（圖十一），其中Glyma.01g118000表現量高達對照組7000倍，為表現最顯著基因。本研究整合統計、網絡與實驗數據，有效驗證多層次分析所選拔FTgenes之功能，為後續耐淹水分子育種提供可靠依據。