利用全基因組關聯分析及系統生物學分析選拔大豆生長初期耐寒基因

大豆[Glycine max (L.) Merr.]富含脂質、蛋白質與多種人體所需之胺基酸，是目前全球重要的農藝作物之一。近年來，全球作物遭遇乾旱、寒害與淹水等非生物逆境，導致糧食生產供應風險增加。大豆是對低溫敏感的作物，國內大豆的種植分布受限於栽培期間氣候不確定性，因此，我們亟需一套新穎的系統性的育種策略，選育能因應氣候逆境且具高價值性狀之大豆品種。本研究整合全基因組關聯定位分析(genome-wide association study, GWAS)、體學與非體學(omics and non-omics, OnO)資料特徵選取與特徵擷取(feature selection and extraction)，建立44個短期(12hr)、143中期(12- 48hr)、45長期(>48hr)在低溫處理(<15℃)後與低溫耐受性或反應顯著相關耐寒基因(cold tolerant response genes, CTgenes) (圖一)。我們使用2周大的大豆幼苗經冷處理(1hr、12hr)葉片之RNA-seq資料(49,778個基因表現資料) (Yamasaki & Randall, 2016)，做為大豆耐寒基因性狀測試基因集。相較於其他方法挑選的基因，我們選拔的CTgenes在測試基因集有較佳(p值皆顯著小於0.05)的表現(圖二)。
我們利用系統生物學方法精簡並選拔大豆耐寒反應關鍵基因，首先，我們盤點並整理大豆基因功能之13,292個GO term資料，排除大於2500與小於5個基因之GO term，分別建立大豆102個短期、349個中期、100個長期與耐寒反應相關GO基因路徑，並建置GO路徑資料類別之數據(圖三)。進一步，我們導入comparative及self-contained等基因功能路徑方法，檢定44個短期耐寒基因、143個中期耐寒基因、45個長期耐寒基因，建立基因功能路徑圖譜(圖四)。在Comparative方法(超幾何檢定、GSEA)，分別計有6條和21條生物路徑與耐寒反應顯著相關。GSEA結果顯示短期與長期耐寒基因與regulation of timing of transition from vegetative to reproductive phase顯著相關；中期與polyamine biosynthetic process、spermidine biosynthetic process及negative regulation of abscisic acid mediated signaling pathway等生物路徑顯著相關。這些生物路徑與離層酸調控、胺基酸生合成息息相關。超幾何檢定結果顯示短期耐寒基因與cold acclimation、defense response to fungus、ethylene mediated signaling pathway及response to water deprivation等生物路徑相關；中期耐寒基因則有12條顯著生物途徑，與茉莉酸調控、離層酸調控、水楊酸調控高度相關；長期耐寒基因功能與乙烯訊號調控相關。相較於Comparative方法，Self-contained方法(SUMSTAT、SUMSQ檢定) (圖五)分別篩選出26條及27條生物路徑與耐寒基因顯著相關。兩種檢定顯著相關的生物途徑重複性高。短期耐寒基因與positive regulation of transcription, DNA-dependent、ethylene mediated signaling pathway、defense response to fungus、cold acclimation等生物途徑顯著相關，這些途徑與乙烯生合成、冷馴化、轉錄調控等相關。中期耐寒基因與細胞凋亡、茉莉酸生合成、水楊酸生合成等生物途徑顯著相關。
研究中為進一步探索大豆耐寒反應基因之網路圖譜，我們導入pathway crosstalk及protein-protein interaction network分析。我們從GSEA、超幾何檢定、SUMSTAT及SUMSQ檢定顯著之生物途徑中，篩選12條至少在兩個時期顯著(P-value小於0.0005)相關之生物途徑，進行網路分析選拔大豆耐寒反應關鍵基因。在Pathway crosstalk網路圖譜(圖六)中，2條生物途徑(intracellular signal transduction及response to jasmonic acid stimulus)具有完全群聚係數(即clustering coefficient等於1)，另外10條生物途徑之連接度(degree)皆高於10。結點越大表示所含耐寒基因的個數多，而
連線越粗則表示兩結點共同基因越多。因此，由網路拓樸性質得知這些耐寒反應基因的交互協調作用非常顯著。
本研究進一步選取68個來自12條pathway crosstalk顯著生物途徑之耐寒相關基因，進行PPI網路分析耐寒反應基因之拓樸性質。研究中採用之蛋白質資料蒐集自PlantRegMap (http:// plantregmap.cbi.pku.edu.cn/) PPIs資料庫(Jin et al., 2017)，共計54,140個基因與717,676對PPI納入網路分析。在耐寒基因PPI網路中，僅挑選至少含有一個耐寒反應基因的PPIN，共計25,728個基因納入分析，其中結點連結度為6.35，群聚係數為0.13，顯示這些PPIN具有中高度的群聚性。進一步從中挑選出6個高群聚(度>4000)的基因(Glyma.09g238800、Glyma.13g233800、Glyma.08g168100、Glyma.11g036400、Glyma.10g180800、Glyma.20g209700)繪製可視化的PPIN圖譜(圖七)。這些關鍵基因具有高度拓樸性質，包含豐富的基因體及蛋白質體資訊，可以做為後續育種之重要依據。