反轉錄病毒起動子捕捉載體之製造

本實驗之目的，在改良反轉錄病毒起動子捕捉載體，以期更有效率的捕捉細胞基因的起動子。U3β-Geo/supF質體3端不帶有促進子的LTR的U3區插入了在同一解讀架構上的β-galactosidase (β-gal)和neomycin phosphotransferase (neo)的雜合標識基因(簡稱β-geo)。我們將U3β- geo/supF質體3端U3區之起動子序列切除，得到ΔU3β-geo/supF質體，以去除起始於5端LTR而終止於3端LTR的轉錄，進而提高起動子捕捉的效率。此外，我們以pBR322質體之複製起源點(ori)及β-lactamase基因(amp)置換ΔU3β-geo/supF質體之supF基因，得到ΔU3β-geo/ori-amp質體，此法有利於病毒插入處鄰近細胞序列的選殖。將各重組質體轉移入ψ2細胞，得到重組病毒製造細胞株，其病毒價數，可籍感染NIH3T3細胞來測定。U3β-geo/supF重組病毒感染之細胞生長良好、緻密，有較多大型細胞株形成。切除U3區之起動子的重組病毒感染之細胞則生長緩慢、不緻密，大型細胞株很少。U3β-geo/supF重組病毒價數與其他已知之鼠類白血病毒價數相近，故推論在LTR上插入3.9kbβ-geo基因並不會影響病毒的複製、插入或包裝。ΔU3β-geo/ori-amp重組病毒價數則降低50%。故推論pBR322質體之ori-amp基因上的有毒序列可能會影響病毒的複製或插入，或者ori/-amp基因之置入，使病毒增長2.1Kb，可能造成病毒包裝的困難而導致病毒價數的降低。