水稻（Oryza Sativa L.） Osm34分泌性蛋白質的基因選殖及第三型幾丁質酶基因家族的親緣關係分析

Gene Cloning of Rice (Oryza sativa L.) Osm34 Secretory Protein and Phylogenetic Analysis of the Class III Chitinase Gene Family

本研究從水稻細胞的培養液中，分離出一分子量為34kDa的分泌性蛋白質(Osm34)，經由N端胺基酸微定序分析及基因選殖的結果顯示：不包含分泌訊息序列的Osm34 cDNA長度為1045bp，可轉譯出含有282個胺基酸，等電點為4.94的蛋白質。Osm34的胺基酸序列中，除了具有醣苷水解酵素第18家族成員所特有的兩個保守序列「104RVAVSMGG111」和「146LDGIDIDYE154」之外，胺基酸序列一致度(identity)的比對結果也顯示該蛋白質為一個由我們最先鑑定的水稻第III型幾丁質酶，我們已將其序列註冊於GenBank，編號為AF330230。水稻基因組資料庫中，共登錄有32個具保守序列的第III型幾丁質酶。我們對這些幾丁質酶進行多序列比對與親緣關係分析，結果顯示這些幾丁質酶可被分類至IIIa和IIIb兩個亞型(subc1asses)。III a亞型共包含有29個蛋白質，其胺基酸序列的一致度介於34-85%之間；IIIb亞型雖僅含有3個蛋白質，但其胺基酸序列的一致度高達50-83%；不同亞型之間，胺基酸序列的一致度則低於25%。由前人的研究(Bokma et al., 2002)得知，第III型幾丁質酶保守序列「DXXDXDXE」中的D和E為影響酵素活性的兩個關鍵胺基酸，但我們發現在IIIa亞型的29個幾丁質酶中，有20個成員的這兩個關鍵胺基酸發生變異，可能會導致酵素活性或受質專一性的改變。若將此一因素列入考量，我們建議將IIIa亞型幾丁質酶進一步區分為兩個次亞型(sub-subclasses)，兩個關鍵胺基酸維持不變的九個成員為III a-1次亞型，而兩個關鍵胺基酸從D和E變異成F/Y和D的20個成員則為IIIa-2次亞型。如此，屬於III a-1次亞型的幾丁質酶彼此間胺基酸序列一致度也可提高到48-69%，而同屬IIIa-2次亞型內的幾丁質酶其胺基酸序列一致度則增加為43-85%。